Bagaimana Deteksi SARS-CoV-2 atau COVID-19 menggunakan metode Real-Time PCR

Seperti yang sudah sering diberitakan oleh media, metode deteksi COVID-19 ada dua, yaitu rapid test dan PCR. Deteksi menggunakan PCR yang dimaksud oleh media adalah deteksi menggunakan Real-Time PCR. Bagaimana metode ini dapat dilakukan?

Pertama, kita harus mengetahui terlebih dahulu struktur dari virus SARS-CoV-2. Seperti coronavirus pada umumnya, SARS-CoV-2 memiliki protein nucleocapsid (N), membran glycoprotein (M), protein spike (S), protein envelope (E), materi genetik yang berupa RNA utas tunggal.

Materi genetik RNA inilah yang akan kita gunakan untuk deteksi SARS-CoV-2 penyebab COVID-19.

Tahapan deteksi secara garis besar adalah;

  1. Pengambilan Swab
  2. Ekstraksi RNA
  3. Deteksi dengan Reverse Transcriptase Quantitative PCR (RT-qPCR)

Pengambilan Sampel Swab

Koleksi sampel dilakukan oleh tenaga medis, berupa swab nasofaring dan orofaring dalam tube yang berisi Viral Transport Media (VTM).

Ekstraksi RNA

Sampel diekstraksi untuk mendapatkan materi genetik yang berupa RNA dan memurnikannya dari komponen lain. Ekstraksi yang menggunakan Sera-Xtracta™ Virus/Pathogen Kit membutuhkan waktu 30 menit per 6 sampel. Perhitungan waktu sudah termasuk handling time (yang subjektif terhadap pengalaman user dalam ekstraksi RNA).

Deteksi dengan Quantitative Reverse Transcriptase PCR (qRT-PCR)

Hasil ekstraksi RNA kemudian masuk ke tahap selanjutnya, yaitu RT-qPCR. Untuk pengantar saja, mimin akan jelaskan mengenai Real-Time PCR, yaitu metode yang digunakan untuk memperbanyak (amplifikasi) bagian dari DNA. Metode Real-Time PCR memungkinkan kita untuk memantau proses amplifikasi secara langsung, dan data yang dihasilkan berupa kurva untuk melihat hasil positif atau negatif suatu sampel.

Kemudian, apabila PCR digunakan untuk mengamplifikasi DNA, bagaimana dengan SARS-CoV yang memiliki materi genetik berupa RNA?

Metode yang digunakan untuk deteksi ini adalah RT-qPCR. Reverse transcriptase adalah sebuah teknik yang digunakan untuk mengubah RNA utas tunggal menjadi DNA utas ganda. Hasil transkripsi balik ini dapat diamplifikasi dalam proses PCR.

Ada dua jenis qRT-PCR, one step dan two step qRT-PCR. Two step qRT-PCR adalah metode dimana transkripsi balik RNA dilakukan terlebih dahulu dan terpisah dari proses qPCR. One step qRT-PCR, merupakan metode dimana Reverse transcriptase dan qPCR berjalan dengan bersamaan. Salah satu komponen yang dibutuhkan dalam proses ini ialah mastermix yaitu komponen enzim dan bahan penunjang lainnya. Mastermix yang akan kami bahas disini merupakan adalah TaqPath™ 1-Step Multiplex Master Mix (No ROX™) yang merupakan mastermix untuk one step RT-qPCR dan juga multiplex, mastermix multiplex ini mampu melakukan deteksi lebih dari satu target dalam satu reaksi.

Reaksi multiplex ini sangat menguntungkan apabila sampel yang akan diuji banyak, karena satu kali run, kapasitas instrumen qPCR plate adalah 96 reaksi, maka dengan kit multiplex ini mampu mendeteksi 94 sampel sekaligus, dengan 1 kontrol positif dan 1 kontrol negatif dalam satu kali
running. Apabila dilakukan dengan singleplex, setiap marka harus dilakukan dalam reaksi yang berbeda. Jumlah well semakin banyak karena target dalam satu sample ada 3, jadi sudah mengakuisisi 3 well. Berarti, jika kita hitung, dalam satu plate instrument qPCR 6 well sudah diakomodir untuk kontrol positif dan negatif. Maka ada 90 well untuk 30 sampel. Jadi sudah jelas keuntungan dari reaksi multiplex ini, apalagi ditengah pandemi ini yang membutuhkan tes yang banyak.

Marka target sudah bisa didapatkan dalam TaqPath™ COVID-19 Combo Kit yang memiliki marka untuk 4 gen target yaitu gen Orf-1ab (RdRP),N Protein, S Protein, dan MS2 phage. Bagian dari gen coronavirus yang akan diamplifikasi adalah gen Orf-1ab (RdRP) , N Protein, dan S Protein yang
ada dalam materi genetic virus. Sedangkan MS2 merupakan kontrol ekstraksi. Kombinasi 3 gen ORF 1ab, N dan S dipilih dengan mempertimbangkan ke tiga area ini menunjukan % similaritas yang cukup rendah dengan strain (jenis) coronavirus lain. Gen S dari analisa bioinformatika merupakan region yang memiliki similaritas paling rendah (75%) dibandingkan dengan strain coronavirus lain, sehingga gen S merupakan target yang ideal digunakan baik sebagai penampisan maupun konfirmasi dalam target assay.

Waktu running yang dibutuhkan sekitar satu jam. Belum termasuk handling time yang subjektif terhadap kemampuan user dalam preparasi qRT-PCR.

Setelah running, Analisa data dilakukan, Applied Biosystems kini memiliki COVID-19 interpertative software yang dapat secara otomatis menganalisa data hasil running dalam waktu kurang dari 5 menit. Software ini kompatibel dengan 7500 Fast Real-Time PCR, 7500 Real-Time PCR, QuantStudio 5 Real-Time PCR. Namun analisa juga dapat dilakukan secara manual. Ada beberapa ketentuan untuk intepertasi hasil. Seperti kombinasi gen yang terdeteksi untuk dinyatakan positif, negative atau invalid (harus diulang).

Jadi setelah penjelasan diatas, mari kita hitung kisaran waktu yang dibutuhkan untuk deteksi COVID-19 ini. Untuk esktraksi RNA 6 sampel membutuhkan waktu 30 menit, untuk deteksi RT-qPCR dibutuhkan waktu sekitar 2 jam dengan handling time. Dan interpretasi hasil jika dilakukan secara otomatis hanya 5 menit saja. Jadi total waktu yang dibutuhkan untuk deteksi COVID-19 kurang lebih 3 jam.

Semoga artikel singkat ini dapat membantu anda sedikit lebih memahami mengenai proses deteksi COVID-19. Jika ada yang ingin anda ketahui lebih lanjut silahkan hubungi kami melalui social media, atau email kami. Atau ingin meminta kami membahas suatu topik yang berhubungan dengan COVID-19 atau lainnya yang masih dalam bidang kami, silahkan hubungi kami