Apakah Anda Sudah Melakukan Percobaan Real-Time PCR dengan Baik?
10 September 2024
10 Sep Apakah Anda Sudah Melakukan Percobaan Real-Time PCR dengan Baik?
“Pertanyaan yang sering ditanyakan pada saya adalah, apakah saya telah melakukan Real-Time PCR dengan benar?” Marcia Slater mulai bekerja dengan Real-Time PCR 20 tahun yang lalu, pada saat metode ini baru dikembangkan. Beliau telah mendapatkan banyak informasi dari pengalamannya bekerja menggunakan teknik ini, baik sebagai Field Application Specialist dan sekarang di marketing.
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknologi biomolekuler yang paling mutakhir. PCR dapat memperbanyak atau (amplifikasi) sekuens dalam template DNA atau DNA komplementer (cDNA) menjadi ribuan kali lipat menggunakan oligonukleotida, DNA polimerase yang stabil pada suhu tinggi, dan thermal cycling. Pada Real-Time PCR atau qPCR, kita mengukur jumlah DNA (amplikon) dari setiap siklus menggunakan pewarna fluoresense yang menghasilkan peningkatan sinyal fluoresense seiring dengan meningkatnya produk PCR (amplikon). Idealnya, pada setiap siklus PCR, DNA target akan berduplikasi. Kami mengambil data selama siklus ini berlangsung dan memfokuskan analilsis pada fase eksponensial reaksi, yaitu dimana fase duplikasi terjadi. Begitulah proses kita mendapat informasi dari kuantitas awal DNA target menggunakan reporter floresens. Perubahan floresensi ini diukur secara konstan oleh instrument thermalcycler dengan Kapasitas pemindai pewarna fluoresens. Dengan memplotkan tingkat fluoresens terhadap jumlah siklus, instrument qPCR menghasilkan grafik yang merepresentasikan akumulasi produk selama proses PCR. Artinya, Anda dapat melihat apa yang terjadi selama reaksi, yang memberikan banyak informasi tambahan mengenai eksperimen real-time PCR.
qPCR lebih kompleks dari yang terlihat
qPCR bisa jadi sangat mudah dilakukan, tapi bisa juga sangat sulit untuk dilakukan, kata Slater. Menurut publikasi terkini, qPCR lebih kompleks dari yang dibayangkan oleh banyak ilmuan—terutama saat eksperimen qPCR dilakukan dalam riset saintifik, dimana semua primer dan probe perlu didesain untuk deteksi spesifik. Eksperimen-eksperimen ini sering membutuhkan kuantifikasi level asam nukleat antara dua keadaan uji eksperimental. “Ketika seluruh penelitian Anda didasarkan pada hasil ini, Anda benar-benar ingin melakukannya dengan benar, ” canda Slater. “Menurut pengalaman saya, protokol yang tidak memadai dan berbeda antar laboratorium juga benar-benar membuat frustrasi dalam menyusun data”
Pedoman Minimum Information for Publication of Quantitative real-time PCR experiments (MIQE) telah membantu para ilmuan untuk menghasilkan data yang lebih konsisten dan dapat dipertanggung jawabkan . Namun, kualitas data qPCR yang telah dipublikasi tetap saja menjadi perhatian.
“Aku rasa, setelah kamu mempelajari sedikit lebih dalam mengenai latar belakang qPCR, dan meluangkan waktu untuk mempelajari perbedaan tahapan krusial dalam eksperimen qPCR, hal itu akan jadi lebih mudah,” kata Slater
Beberapa aspek krusial dalam mengatur eksperimen qPCR adalah pemilihan primer dan probes, kontrol terbaik untuk eksperimen anda, dan melting curve jika anda menggunakan SYBR Green.
- Rox sebagai Passive Reference Dye, Apa sih Gunanya?
Dalam analisis real-time PCR, passive reference dyes sering digunakan untuk menormalkan sinyal fluoresensi… - Istilah yang wajib dipahami saat melakukan qPCR
Baseline Baseline pada reaksi real-time PCR merujuk pada tingkat sinyal fluoresensi pada siklus… - Mengenal PCR, Teknik Penting di Balik Tes COVID-19 dan Riset Genetik
Apa itu PCR? Bayangkan ada sebuah teknologi kecil yang bekerja diam-diam tetapi punya… - Kualitas Genetik Sel Telur Tetap Terjaga: Studi Penn State Tantang Paradigma Lama Reproduksi Wanita
“Cepat menikah, nanti kalau sudah tua susah punya anak,” Kalimat itu sering didengar… - Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Peran Vital Primer dalam Keberhasilannya
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah salah satu inovasi terbesar dalam biologi molekuler, ditemukan…
Thermo Fisher Scientific menyediakan handbook qPCR yang meliputi modul interaktif yang menjelaskan seluruh tahapan krusial untuk mensetting eksperimen qPCR. Handbook ini dapat diakses secara digital di sini