Apakah Anda Sudah Melakukan Percobaan Real-Time PCR dengan Baik?
10 September 2024
10 Sep Apakah Anda Sudah Melakukan Percobaan Real-Time PCR dengan Baik?
“Pertanyaan yang sering ditanyakan pada saya adalah, apakah saya telah melakukan Real-Time PCR dengan benar?” Marcia Slater mulai bekerja dengan Real-Time PCR 20 tahun yang lalu, pada saat metode ini baru dikembangkan. Beliau telah mendapatkan banyak informasi dari pengalamannya bekerja menggunakan teknik ini, baik sebagai Field Application Specialist dan sekarang di marketing.
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknologi biomolekuler yang paling mutakhir. PCR dapat memperbanyak atau (amplifikasi) sekuens dalam template DNA atau DNA komplementer (cDNA) menjadi ribuan kali lipat menggunakan oligonukleotida, DNA polimerase yang stabil pada suhu tinggi, dan thermal cycling. Pada Real-Time PCR atau qPCR, kita mengukur jumlah DNA (amplikon) dari setiap siklus menggunakan pewarna fluoresense yang menghasilkan peningkatan sinyal fluoresense seiring dengan meningkatnya produk PCR (amplikon). Idealnya, pada setiap siklus PCR, DNA target akan berduplikasi. Kami mengambil data selama siklus ini berlangsung dan memfokuskan analilsis pada fase eksponensial reaksi, yaitu dimana fase duplikasi terjadi. Begitulah proses kita mendapat informasi dari kuantitas awal DNA target menggunakan reporter floresens. Perubahan floresensi ini diukur secara konstan oleh instrument thermalcycler dengan Kapasitas pemindai pewarna fluoresens. Dengan memplotkan tingkat fluoresens terhadap jumlah siklus, instrument qPCR menghasilkan grafik yang merepresentasikan akumulasi produk selama proses PCR. Artinya, Anda dapat melihat apa yang terjadi selama reaksi, yang memberikan banyak informasi tambahan mengenai eksperimen real-time PCR.
qPCR lebih kompleks dari yang terlihat
qPCR bisa jadi sangat mudah dilakukan, tapi bisa juga sangat sulit untuk dilakukan, kata Slater. Menurut publikasi terkini, qPCR lebih kompleks dari yang dibayangkan oleh banyak ilmuan—terutama saat eksperimen qPCR dilakukan dalam riset saintifik, dimana semua primer dan probe perlu didesain untuk deteksi spesifik. Eksperimen-eksperimen ini sering membutuhkan kuantifikasi level asam nukleat antara dua keadaan uji eksperimental. “Ketika seluruh penelitian Anda didasarkan pada hasil ini, Anda benar-benar ingin melakukannya dengan benar, ” canda Slater. “Menurut pengalaman saya, protokol yang tidak memadai dan berbeda antar laboratorium juga benar-benar membuat frustrasi dalam menyusun data”
Pedoman Minimum Information for Publication of Quantitative real-time PCR experiments (MIQE) telah membantu para ilmuan untuk menghasilkan data yang lebih konsisten dan dapat dipertanggung jawabkan . Namun, kualitas data qPCR yang telah dipublikasi tetap saja menjadi perhatian.
“Aku rasa, setelah kamu mempelajari sedikit lebih dalam mengenai latar belakang qPCR, dan meluangkan waktu untuk mempelajari perbedaan tahapan krusial dalam eksperimen qPCR, hal itu akan jadi lebih mudah,” kata Slater
Beberapa aspek krusial dalam mengatur eksperimen qPCR adalah pemilihan primer dan probes, kontrol terbaik untuk eksperimen anda, dan melting curve jika anda menggunakan SYBR Green.
- Mengenal Biologi Molekuler Kanker: Dari Mekanisme hingga Pengobatan PresisiSetiap tahun, tanggal 4 Februari diperingati sebagai Hari Kanker Sedunia. Hari ini menandai 25 tahun sejak penandatanganan Charter of Paris Against Cancer pada World Summit Against Cancer for the New Millennium. Pada peringatan Hari Kanker Sedunia tahun ini dengan tema United by Unique, yang mengingatkan…
- Manfaat Kesehatan Cuka Apel: Sekutu Alami Melawan DiabetesCuka apel telah mendapatkan popularitas luas dalam beberapa tahun terakhir sebagai obat alami serbaguna. Di antara banyak manfaat kesehatannya, perannya dalam mengelola dan kemungkinan mengurangi risiko diabetes sangat menonjol. Dengan dukungan dari penelitian ilmiah dan bukti anekdotal selama berabad-abad, cuka apel semakin diakui sebagai alat…
- Terobosan Terapi Kanker: Metabolic TherapyKanker adalah salah satu penyebab utama kematian di seluruh dunia, termasuk di Indonesia. Menurut data Globocan 2020, lebih dari 396.000 kasus baru kanker terdiagnosis setiap tahunnya di Indonesia, dengan kanker payudara, leher rahim, dan paru-paru menjadi jenis yang paling umum. Tingginya prevalensi ini menunjukkan bahwa…
- Resistensi Obat HIV, Fakta-Fakta yang Perlu Kamu TahuOrganisasi Kesehatan Dunia (WHO) melaporkan bahwa pada akhir tahun 2021, sekitar 75% (28,7 juta) pasien HIV menerima terapi antiretroviral (ART). Pada saat yang sama, peningkatan tingkat resistensi obat ARV telah diamati [1]. Resistensi ARV memiliki kemungkinan berkembang lebih tinggi pada pasien yang tidak mengikuti terapi ARV…
- Applied Biosystems Real-Time PCR User Group MeetingPanel Topics – Human Health – Animal Health, Agrigenomic, Drug and Food Safety – Basic Science Research
Thermo Fisher Scientific menyediakan handbook qPCR yang meliputi modul interaktif yang menjelaskan seluruh tahapan krusial untuk mensetting eksperimen qPCR. Handbook ini dapat diakses secara digital di sini