10 Sep Apakah Anda Sudah Melakukan Percobaan Real-Time PCR dengan Baik?

“Pertanyaan yang sering ditanyakan pada saya adalah, apakah saya telah melakukan Real-Time PCR dengan benar?” Marcia Slater mulai bekerja dengan Real-Time PCR 20 tahun yang lalu, pada saat metode ini baru dikembangkan. Beliau telah mendapatkan banyak informasi dari pengalamannya bekerja menggunakan teknik ini, baik sebagai Field Application Specialist dan sekarang di marketing.

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknologi biomolekuler yang paling mutakhir. PCR dapat memperbanyak atau (amplifikasi) sekuens dalam template DNA atau DNA komplementer (cDNA) menjadi ribuan kali lipat menggunakan oligonukleotida, DNA polimerase yang stabil pada suhu tinggi, dan thermal cycling. Pada Real-Time PCR atau qPCR, kita mengukur jumlah DNA (amplikon) dari setiap siklus menggunakan pewarna fluoresense yang menghasilkan peningkatan sinyal fluoresense seiring dengan meningkatnya produk PCR (amplikon). Idealnya, pada setiap siklus PCR, DNA target akan berduplikasi. Kami mengambil data selama siklus ini berlangsung  dan memfokuskan analilsis pada fase eksponensial reaksi, yaitu dimana fase duplikasi terjadi. Begitulah proses kita mendapat informasi dari kuantitas awal DNA target menggunakan reporter floresens. Perubahan floresensi ini diukur secara konstan oleh instrument thermalcycler dengan Kapasitas pemindai pewarna fluoresens. Dengan memplotkan tingkat fluoresens terhadap jumlah siklus, instrument qPCR menghasilkan grafik yang merepresentasikan akumulasi produk selama proses PCR. Artinya, Anda dapat melihat apa yang terjadi selama reaksi, yang memberikan banyak informasi tambahan mengenai eksperimen real-time PCR.

qPCR lebih kompleks dari yang terlihat

qPCR bisa jadi sangat mudah dilakukan, tapi bisa juga sangat sulit untuk dilakukan, kata Slater. Menurut publikasi terkini, qPCR lebih kompleks dari yang dibayangkan oleh banyak ilmuan—terutama saat eksperimen qPCR dilakukan dalam riset saintifik, dimana semua primer dan probe perlu didesain untuk deteksi spesifik. Eksperimen-eksperimen ini sering membutuhkan kuantifikasi level asam nukleat antara dua keadaan uji eksperimental. “Ketika seluruh penelitian Anda didasarkan pada hasil ini, Anda benar-benar ingin melakukannya dengan benar, ” canda Slater. “Menurut pengalaman saya, protokol yang tidak memadai dan berbeda antar laboratorium juga benar-benar membuat frustrasi dalam menyusun data”

Pedoman Minimum Information for Publication of Quantitative real-time PCR experiments (MIQE) telah membantu para ilmuan untuk menghasilkan data yang lebih konsisten dan dapat dipertanggung jawabkan . Namun, kualitas data qPCR yang telah dipublikasi tetap saja menjadi perhatian.

“Aku rasa, setelah kamu mempelajari sedikit lebih dalam mengenai latar belakang qPCR, dan meluangkan waktu untuk mempelajari perbedaan tahapan krusial dalam eksperimen qPCR, hal itu akan jadi lebih mudah,” kata Slater

Beberapa aspek krusial dalam mengatur eksperimen qPCR adalah pemilihan primer dan probes, kontrol terbaik untuk eksperimen anda, dan melting curve jika anda menggunakan SYBR Green.

• 
  Menjaga yang Tak Terlihat: Tantangan dan Terobosan dalam Sterilitas Terapi Sel
  Produksi terapi sel, terutama seperti CAR-T, merupakan proses kompleks dan sangat sensitif terhadap kontaminasi mikroba. Keberhasilan terapi tidak hanya ditentukan oleh efikasi biologis, tetapi juga oleh seberapa steril dan aman produk yang diberikan ke pasien. Dalam konteks ini, pengujian kesterilan menjadi elemen krusial dalam memastikan…
• 
  Genomic Breeding untuk Tanaman, Mulai Dari Mana?
  Sebelumnya, kita telah membahas bagaimana pemuliaan tanaman berperan penting dalam menghasilkan varietas unggul dengan sifat-sifat yang diinginkan, seperti tahan penyakit, produktivitas tinggi, atau adaptif terhadap perubahan iklim. Seiring kemajuan ilmu pengetahuan, kini proses pemuliaan tidak lagi terbatas pada metode konvensional. Berkat perkembangan teknologi genomik, kita…
• 
  Benih Masa Depan: Inovasi Genetik dalam Pemuliaan Tanaman
  Seperti yang kita tahu melalui hukum mendel bahwa sifat dapat diwariskan. Eksperimennya menyilangkan kacang polong menunjukkan bahwa sifat-sifat tanaman diturunkan dari induk melalui “faktor pewarisan” (yang sekarang kita kenal sebagai gen). Hukum Mendel ini menjadi pondasi penting dalam semua praktik pemuliaan tanaman hingga sekarang. Pemuliaan…
• 
  FREE WEBINAR | Back to the Basics of A–T–G–C: The Enduring Power of Sanger Sequencing
   ⚙️Sejak dikembangkan pada tahun 1977 oleh Frederick Sanger, metode Sanger sequencing tetap menjadi standar emas dalam teknologi pengurutan DNA. Meskipun telah hadir teknologi next-generation sequencing (NGS), Sanger sequencing masih memegang peran penting dalam berbagai aplikasi penelitian karena akurasinya, kesederhanaan metode, dan efektivitas biayanya untuk proyek…
• 
  FREE WEBINAR : The Role of Chromosomal Microarray Analysis (CMA) in Diagnosing Genetic Disorders
  ⚙️Chromosomal Microarray Analysis (CMA) telah menjadi metode diagnostik utama dalam mendeteksi kelainan genomik submikroskopik seperti copy number variations (CNVs), yang sering tidak terdeteksi melalui teknik konvensional seperti karyotyping 🧬 Menurut American College of Medical Genetics (ACMG), CMA direkomendasikan sebagai first-tier test untuk analisis genetik pascanatal…

Thermo Fisher Scientific menyediakan handbook qPCR yang meliputi modul interaktif yang menjelaskan seluruh tahapan krusial untuk mensetting eksperimen qPCR. Handbook ini dapat diakses secara digital di sini