Istilah yang wajib dipahami saat melakukan qPCR

20 February 2026
Istilah dalam qPCR

20 Feb Istilah yang wajib dipahami saat melakukan qPCR

Posted at 16:51h in Science by

Baseline

Baseline pada reaksi real-time PCR merujuk pada tingkat sinyal fluoresensi pada siklus awal PCR, umumnya antara siklus ke-3 hingga ke-15, di mana belum terjadi peningkatan sinyal yang signifikan. Pada fase ini, sinyal fluoresensi yang terdeteksi terutama berasal dari latar belakang (background) atau noise reaksi, bukan dari produk amplifikasi target.

Penentuan baseline dilakukan secara empiris, baik melalui pengaturan manual oleh pengguna maupun secara otomatis oleh perangkat lunak instrumen qPCR berdasarkan kurva amplifikasi. Penetapan baseline yang tepat sangat penting karena akan memengaruhi penentuan threshold cycle (Ct).

Baseline harus ditentukan dari sejumlah siklus awal yang merepresentasikan sinyal latar belakang, sebelum sinyal amplifikasi mulai meningkat secara nyata. Dalam perbandingan antar reaksi atau eksperimen qPCR, baseline harus ditetapkan dengan cara yang konsisten.

Threshold

Threshold merupakan tingkat sinyal fluoresensi yang menunjukkan peningkatan signifikan di atas baseline. Nilai ini digunakan untuk membedakan sinyal amplifikasi yang relevan dari sinyal latar belakang.

Pada umumnya, perangkat lunak instrumen qPCR secara otomatis menentukan threshold pada nilai sekitar 10 kali standar deviasi sinyal fluoresensi baseline. Namun, threshold juga dapat ditetapkan secara manual, selama posisinya berada pada fase eksponensial reaksi PCR.

Ct (Threshold Cycle)

Ct (threshold cycle) adalah nomor siklus PCR ketika sinyal fluoresensi pertama kali melampaui threshold. Nilai Ct digunakan untuk memperkirakan jumlah awal DNA target, di mana nilai Ct berbanding terbalik dengan jumlah template awal.

Sebagai contoh, jika dua sampel dibandingkan dan salah satunya memiliki jumlah template awal dua kali lebih banyak, maka sampel tersebut akan mencapai threshold satu siklus lebih awal (Ct lebih rendah), dengan asumsi efisiensi PCR sebesar 100%.

Dalam seri pengenceran 10 kali lipat, perbedaan nilai Ct antar sampel idealnya sekitar 3,3 siklus.

Kurva Standar (Standard Curve)

Kurva standar dibuat dari seri pengenceran template dengan konsentrasi diketahui, yang kemudian diamplifikasi menggunakan qPCR. Nilai log konsentrasi template diplot pada sumbu x, sedangkan nilai Ct diplot pada sumbu y.

Kurva ini digunakan untuk:

  • menentukan jumlah awal target pada sampel tidak diketahui,
  • mengevaluasi performa reaksi,
  • menghitung efisiensi amplifikasi.

Konsentrasi template pada kurva standar sebaiknya mencakup kisaran konsentrasi target yang diharapkan pada sampel eksperimen.

Koefisien Korelasi (R²)

Koefisien korelasi (R²) menunjukkan tingkat linearitas hubungan antara nilai Ct dan konsentrasi template pada kurva standar. Nilai R² yang mendekati 1 menunjukkan bahwa data mengikuti hubungan linear dengan baik.

Secara praktis, nilai R² sebesar 0,999 umumnya dianggap sebagai nilai maksimum yang dapat dicapai pada eksperimen qPCR yang sangat baik.

Fase Eksponensial

Kuantifikasi pada real-time PCR sebaiknya dilakukan pada fase awal eksponensial, bukan pada fase akhir atau fase plateau. Pada fase ini:

  • reagen masih tersedia dalam jumlah berlebih.
  • DNA polimerase bekerja secara optimal.
  • produk amplifikasi belum mengganggu proses penempelan primer.

Kondisi tersebut menghasilkan data kuantifikasi yang paling akurat dan reprodusibel.

Slope

Slope dari kurva standar mencerminkan efisiensi reaksi PCR. Untuk reaksi dengan efisiensi ideal sebesar 100%, nilai slope mendekati –3,32.

Slope merupakan salah satu parameter utama untuk menilai kualitas reaksi qPCR.

Efisiensi PCR

Efisiensi PCR dihitung menggunakan persamaan berikut:

Efisiensi = 10^(–1/slope) – 1

Efisiensi sebesar 100% menunjukkan bahwa jumlah DNA target berlipat dua pada setiap siklus selama fase eksponensial. Efisiensi reaksi yang baik berada pada kisaran 90–110%, yang setara dengan nilai slope antara –3,58 hingga –3,10.

Efisiensi dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor, antara lain:

  • panjang dan struktur sekunder amplicon,
  • kandungan GC,
  • kualitas dan konsentrasi enzim,
  • kondisi reaksi,
  • keberadaan inhibitor PCR.

Dynamic Range

Dynamic range adalah rentang konsentrasi template di mana peningkatan jumlah template awal menghasilkan peningkatan produk amplifikasi yang proporsional.

Secara ideal:

  • qPCR untuk DNA plasmid memiliki dynamic range sekitar 7–8 log,
  • qPCR untuk cDNA atau DNA genomik memiliki dynamic range minimal 3–4 log

Kuantifikasi Absolut

Kuantifikasi absolut merupakan pendekatan real-time PCR yang menggunakan kurva standar dari sampel dengan jumlah target yang telah diketahui. Sampel dengan jumlah target tidak diketahui kemudian dikuantifikasi berdasarkan perbandingan nilai Ct terhadap kurva standar tersebut.

Kuantifikasi Relatif

Kuantifikasi relatif membandingkan ekspresi gen target antara dua kondisi atau perlakuan, misalnya antara sampel perlakuan dan kontrol. Hasil analisis dinyatakan sebagai perubahan lipat (fold change) ekspresi gen.

Pendekatan ini memerlukan gen referensi (housekeeping gene), seperti β-actin, untuk mengontrol variasi teknis antar sampel.

Melting Curve (Dissociation Curve)

Melting curve menggambarkan perubahan sinyal fluoresensi yang terjadi ketika DNA untai ganda (double-stranded DNA, dsDNA) terdisosiasi menjadi DNA untai tunggal (single-stranded DNA, ssDNA) seiring dengan peningkatan suhu reaksi setelah proses amplifikasi PCR selesai.

Pada sistem qPCR berbasis pewarna interkalasi, seperti SYBR® Green I, pewarna akan berikatan dengan dsDNA dan menghasilkan sinyal fluoresensi. Ketika suhu reaksi dinaikkan, dsDNA mulai terpisah pada suhu tertentu yang disebut melting temperature (Tm). Pada titik ini, pelepasan pewarna akibat pemisahan untai DNA menyebabkan penurunan fluoresensi yang tajam.

Dalam analisis melting curve, fluoresensi pertama-tama diplot terhadap suhu. Selanjutnya, perubahan fluoresensi terhadap perubahan suhu (–ΔF/ΔT) diplot terhadap suhu untuk menghasilkan puncak leleh yang lebih jelas, sehingga dinamika proses denaturasi DNA dapat diamati dengan lebih presisi.

Analisis melting curve pasca-amplifikasi merupakan metode yang sederhana dan efektif untuk:

  • mengevaluasi spesifisitas reaksi PCR, dan
  • mendeteksi artefak amplifikasi, seperti primer-dimer.

Suhu leleh DNA dipengaruhi oleh berbagai faktor, termasuk:

  • panjang fragmen DNA,
  • kandungan GC,
  • urutan basa,
  • serta keberadaan mismatch basa.

Oleh karena itu, produk PCR yang berbeda umumnya memiliki karakteristik Tm yang berbeda, sehingga dapat dibedakan berdasarkan profil melting curve-nya. Dengan demikian, analisis melting curve memungkinkan identifikasi produk amplifikasi yang tidak spesifik tanpa perlu melakukan elektroforesis gel, yang lebih memakan waktu dan tenaga.

Melting curve (A) and –ΔF/ΔT vs. Suhu(B).