Purifikasi Antibodi menggunakan AKTA start dan HiTrap Protein G HP Column
12 December 2024
12 Dec Purifikasi Antibodi menggunakan AKTA start dan HiTrap Protein G HP Column
Saat ini, siapa yang tidak mengenal antibodi? Antibodi merupakan jenis protein yang dapat mengikat molekul spesifik yang disebut antigen. Antibodi merupakan komponen penting dalam tubuh yang kehadirannya dapat membantu tubuh kita memerangi beragam infeksi penyakit, seperti infeksi virus menghasilkan antigen spesifik. Belakangan ini, antibodi dapat digunakan untuk aplikasi terapi seperti pemanfaatan monoclonal antibody (mAb) untuk treatment penyakit multiple sclerosis, psoriasis dan beberapa jenis kanker seperti breast cancer dan colorectal cancer. Selain itu pada aplikasi diagnostik, antibodi biasa digunakan sebagai biochemical assay sebagai immunodiagnostic dengan menggunakan teknik immunochemical seperti ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
Metode purifikasi antibodi digunakan untuk mengisolasi polyclonal antibody dari serum, mAb dari cairan ascites atau juga dari supernatant kultur. Dalam proses produksi antibodi, peneliti akan fokus pada kemurnian yang dihasilkan, karena sifat antibodi yang sangat spesifik, sehingga nantinya dapat mendeteksi target antigen yang juga spesifik. Hasil produksi antibodi dengan kemurnian yang tinggi merupakan faktor terpenting yang harus didapatkan.
Masalah seringkali muncul ketika peneliti melakukan purifikasi protein atau antibodi dengan cara manual yang mengharuskan loading sample volume ke dalam kolom dan pemisahan fraksi hasil purifikasi dengan cara manual dan mengakibatkan sering didapatkan yield dengan kemurnian yang rendah dan bervariasi.
AKTA start, merupakan instrument untuk mempurifikasi protein secara otomatis, merupakan solusi bagi setiap peneliti yang berfokus pada penelitian protein, produksi enzim, dan antibodi. Sistem purifikasi otomatis ini dilengkapi dengan software UNICORN start 1.0, yang dapat memudahkan kita dalam handling sampel, analisa, dan pemisahan fraksi-fraksi sampel dengan cara otomatis dari tahap awal hingga didapatkan hasil akhir. Keunggulan dari instrument ini adalah memudahkan proses penelitian dari segi menghemat tenaga dan waktu, dan juga dapat memproses sampel dengan efektif sehingga yield yang diperoleh menjadi lebih tinggi dan konsisten dibandingkan dengan cara manual.
Untuk memisahkan protein dari campurannya, proses purifikasi ini menggunakan kolom yang berisi resin. Resin, dapat juga disebut sebagai media, berfungsi untuk mengisolasi atau menangkap protein target dan memisahkannya dari kontaminan lainnya. Prinsip dasar dari kromatografi kolom adalah adsorpsi solute dalam suatu larutan yang melewati fase stasioner dan memisahkan campuran menjadi komponen-komponen terpisah. Hal ini terjadi berdasarkan afinitas terhadap fase mobile dan fase stasioner. Fase stasioner dalam hal ini berupa partikel-partikel kecil atau resin yang telah di-packing dalam kolom. Resin tersebut akan mengikat atau menolak molekul-molekul tertentu dalam suatu larutan campuran. Molekul yang memiliki afinitas dengan fase stasioner akan terikat dengan resin dan terelusi belakangan, sedangkan yang kurang atau tidak memiliki afinitas dengan fase stasioner akan terelusi dahulu.
Terdapat empat jenis kromatografi yang umumnya dilakukan untuk mempurifikasi protein: affinity chromatography (AC), ion exchange chromatography (IEX), hydrophobic interaction chromatography (HIC), dan size exclusion chromatography (SEC/GF). Affinity chromatography merupakan teknik pemisahan protein berdasarkan interaksi biologis yang spesifik (seperti interaksi antara antibodi dan antigen). Ion exchange chromatography merupakan teknik pemisahan protein berdasarkan perbedaan muatan, dan pemisahan ini bergantung dengan interaksi reversible antara molekul yang bermuatan dengan media kolom yang bermuatan terbalik dengan molekul target (misal: jika protein target bermuatan positif, maka kolom akan bermuatan negative). Hydrophobic interaction chromatography merupakan teknik pemisahan protein berdasarkan perbedaan hidrofobisitas antara permukaan protein target dengan permukaan media dalam kolom.
Terdapat empat jenis kromatografi yang umumnya dilakukan untuk mempurifikasi protein: affinity chromatography (AC), ion exchange chromatography (IEX), hydrophobic interaction chromatography (HIC), dan size exclusion chromatography (SEC/GF). Affinity chromatography merupakan teknik pemisahan protein berdasarkan interaksi biologis yang spesifik (seperti interaksi antara antibodi dan antigen). Ion exchange chromatography merupakan teknik pemisahan protein berdasarkan perbedaan muatan, dan pemisahan ini bergantung dengan interaksi reversible antara molekul yang bermuatan dengan media kolom yang bermuatan terbalik dengan molekul target (misal: jika protein target bermuatan positif, maka kolom akan bermuatan negative). Hydrophobic interaction chromatography merupakan teknik pemisahan protein berdasarkan perbedaan hidrofobisitas antara permukaan protein target dengan permukaan media dalam kolom.
Pemilihan jenis kolom kromatografi yang digunakan juga penting untuk dapat menghasilkan produk protein dengan kemurnian yang tinggi. Terdapat beragam jenis kolom kromatografi yang dapat digunakan salah satu contohnya adalah Hi Trap Protein G HP dari Cytiva (sebelumnya GE Healthcare). Untuk mendapatkan gambaran lebih lanjut, berikut ini adalah salah satu application note Purifikasi mAb dengan metode single step menggunakan Protein G affinity chromatography menggunakan HiTrap Protein G HP; yang mencontohkan penggunaan Protein G untuk purifikasi mAb menggunakan resin protein G.
HiTrap Protein G HP column
Struktur IgG
HiTrap Protein G HP merupakan kolom yang sangat mudah digunakan dan telah mengandung Protein G Sepaharose High Performance Chromatography medium (resin). Resin afinitas Protein G merupakan resin pilihan utama untuk meng-capture antibodi dalam skala laboratorium karena Protein G dapat mengikat IgG dari spesies eukaryotik secara luas dengan spesifisitas tinggi dan dapat mengikat lebih banyak subclass IgG.
Sample yang digunakan untuk percobaan ini merupakan supernatant dari kultur yang diencerkan dua kali menggunakan 20 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.0 sebagai binding buffer (A). Sample yang telah diencerkan lalu disimpan dalam suhu ruang (sekitar 25oC) selama 15-20 menit untuk memastikan bahwa protein telah larut sepenuhnya dalam binding buffer. Sample dapat di-loading ke dalam AKTA start menggunakan syringe untuk volume kecil atau dapat menggunakan Superloop untuk sample dalam volume besar.
Syringe
Superloop
UNICORN start merupakan software yang dapat digunakan untuk men-setting, memantau dan menganalisa selama proses purifikasi protein berlangsung. Protein yang terpurifikasi juga dapat ditampung per fraksi menggunakan fraction collector (misalnya Frac30 untuk AKTA start) untuk membantu memisahkan protein target dari protein non-target atau kontaminan lainnya.
Overview metode yang di-setting dalam software UNICORN start adalah sebagai berikut:
| Method Flow | Method Settings |
| Method Settings | CV |
| Pressure limit 0.3 Mpa | |
| Flow rate 1 mL/min | |
| Prime and equilibration | 5 CV |
| Sample application | Menggunakan pump |
| Sample volume 20 mL | |
| Wash out unbound | 10 CV |
| Elution and fractionation | Gradient elution |
| Fractionation: Peak Fractionation | |
| level based (start/end: 5 mAU) | |
| Prime and equilibration | 5 CV |
Purifikasi mAb ini menggunakan metode kromatografi afinitas menggunakan kolom prepacked dari Cytiva, yaitu kolom HiTrap Protein G HP. Pertama-tama, sampel di-loading kedalam instrument, lalu kolom yang tersambungkan dengan sistem akan dicuci dengan binding buffer sebanyak 10 CV. CV merupakan column volume atau volume kapasitas kolom; CV ini akan berbeda-beda tergantung dengan ukuran volume kolom yang digunakan (misal: jika kolom HiTrap Protein G HP yang digunakan berukuran 1 mL, maka 10 CV = 10 mL).
Step Elution
Gradient Elution
Protein yang telah berikatan dengan kolom akan dielusi menggunakan metode step elution.
Buffer elusi yang digunakan adalah 100 mM glycine-HCl, pH 2.7 (B). Elusi dimulai step pertama, dengan 5 CV dari 70% B untuk menghilangkan kontaminan non-spesific. Lalu step kedua dilakukan dengan 10 CV dari 100% B untuk mengelusi atau melepaskan protein target dari kolom.
Fraksi yang membentuk peak pada software dikumpulkan dengan fraction collector Frac30. Fraksi tersebut adalah mAb yang telah terpurifikasi. Untuk memeriksa kemurnian (purity) dan spesifisitas (specificity) dari mAb yang telah terpurifikasi, fraksi tersebut akan diperiksa kemurniannya menggunakan SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis), dengan gel polyacrylamide 12.5% dan immunodetection.
Hasil
Kondisi running untuk purifikasi mAb adalah sebagai berikut:
| Column | HiTrap Protein G HP, 1 mL |
| Sample | Supernatant kultur yang didilusi sebanyak 2x binding buffer, pH 7 |
| Sample load | 20 mL |
| Binding buffer | 20 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.0 |
| Elution buffer | 100 mM glycine-HCl, pH 2.7 |
| Flow rate | 1 mL/min |
| Gradient | Step 1: 70% B, 5 CV |
| Step 2: 100% B, 10 CV | |
| System | AKTA start, UNICORN start and Frac30 fraction collector |
| Detection | 280 nm (UV) |
Hasil dari purifikasi mAb dengan kolom HiTrap Protein G HP adalah sebagai berikut:
Chromatogram
Profile SDS Phage
– Chromatogram yang menunjukkan profile purifikasi mAb dari supernatant kultur pada AKTA start. Area yang berwarna biru menunjukan fraksi yang mengandung mAb terpurifikasi. Garis merah menandakan konsentrasi gradient pada step gradient saat elusi.
– Profile SDS-PAGE pada gel polyacrylamide gel 12.5% dari protein yang terpurifikasi.
Metode affinity chromatography yang digunakan untuk mempurifikasi mAb dapat menghasilkan kemurnian protein target sebesar >95%. Hasil dari SDS-PAGE dan analisa immunoblot membuktikan bahwa mAb yang telah dipurifikasi tidak mengandung pita protein kontaminan lainnya. Perlakuan ELISA juga membuktikan bahwa mAb yang terpurifikasi bereaksi secara spesifik terhadap antigen, dan aktifitasnya tetap terdeteksi pada konsentrasi serendah 6.25 ng/mL. Sistem AKTA start meningkatkan otomatisasi dalam purifikasi mAb, sehingga dapat menghemat waktu agar dapat melakukan lebih banyak purifikasi dengan hasil yang konsisten.
Kesimpulan
Transisi dari purifikasi manual ke purifikasi otomatis tidaklah sulit ketika menggunakan AKTA start dengan bantuan UNICORN start software dan Frac30 fraction collector, sehingga dapat mempurifikasi mAb dari supernatant kultur dalam purifikasi single step. Dengan menggunakan kolom prepacked HiTrap Protein G HP, mAb yang didapat dengan yield yang tinggi dan hasil yang reproducible.
Diambil dari Application Note 29-0643-02 AB: Purification of antibodies using ÄKTA™ start and HiTrap™ Protein G HP column.
- Mengenal Biologi Molekuler Kanker: Dari Mekanisme hingga Pengobatan Presisi
Setiap tahun, tanggal 4 Februari diperingati sebagai Hari Kanker Sedunia. Hari ini menandai 25 tahun sejak penandatanganan Charter of Paris Against Cancer pada World Summit Against Cancer for the New Millennium. Pada peringatan Hari Kanker Sedunia tahun ini dengan tema United by Unique, yang mengingatkan… - Manfaat Kesehatan Cuka Apel: Sekutu Alami Melawan Diabetes
Cuka apel telah mendapatkan popularitas luas dalam beberapa tahun terakhir sebagai obat alami serbaguna. Di antara banyak manfaat kesehatannya, perannya dalam mengelola dan kemungkinan mengurangi risiko diabetes sangat menonjol. Dengan dukungan dari penelitian ilmiah dan bukti anekdotal selama berabad-abad, cuka apel semakin diakui sebagai alat… - Terobosan Terapi Kanker: Metabolic Therapy
Kanker adalah salah satu penyebab utama kematian di seluruh dunia, termasuk di Indonesia. Menurut data Globocan 2020, lebih dari 396.000 kasus baru kanker terdiagnosis setiap tahunnya di Indonesia, dengan kanker payudara, leher rahim, dan paru-paru menjadi jenis yang paling umum. Tingginya prevalensi ini menunjukkan bahwa… - Resistensi Obat HIV, Fakta-Fakta yang Perlu Kamu Tahu
Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) melaporkan bahwa pada akhir tahun 2021, sekitar 75% (28,7 juta) pasien HIV menerima terapi antiretroviral (ART). Pada saat yang sama, peningkatan tingkat resistensi obat ARV telah diamati [1]. Resistensi ARV memiliki kemungkinan berkembang lebih tinggi pada pasien yang tidak mengikuti terapi ARV… - Applied Biosystems Real-Time PCR User Group Meeting
Panel Topics – Human Health – Animal Health, Agrigenomic, Drug and Food Safety – Basic Science Research