DNA Genomik, Pseudogen, dan Variasi Alel: Hal yang Perlu Diperhatikan dalam Primer & Probe Design

22 September 2026
DNA Genomik, Pseudogen, dan Variasi Alel

22 Sep DNA Genomik, Pseudogen, dan Variasi Alel: Hal yang Perlu Diperhatikan dalam Primer & Probe Design

Posted at 13:49h in Uncategorised by

Kontaminasi DNA genomik (gDNA) pada sampel RNA merupakan salah satu tantangan dalam pengukuran ekspresi gen. gDNA yang terbawa dapat ikut teramplifikasi bersama transkrip target, sehingga menghasilkan data yang tidak valid. Keberadaan gDNA dapat dideteksi melalui reaksi kontrol tanpa enzim reverse transcriptase (RT control). Apabila nilai Ct pada RT control lebih tinggi dibandingkan Ct dari target paling terdilusi, hal ini menunjukkan bahwa gDNA tidak berkontribusi signifikan terhadap pembentukan sinyal. Meskipun demikian, keberadaan gDNA tetap dapat menurunkan efisiensi reaksi akibat kompetisi terhadap komponen reaksi seperti dNTP dan primer.

Strategi paling efektif guna mengeliminasi interferensi gDNA pada real-time PCR adalah melalui optimalisasi desain primer atau probe dengan memanfaatkan keberadaan sekuens intron. Pada sistem TaqMan® Gene Expression Assays, probe idealnya dirancang untuk melintasi persambungan ekson–ekson. Sementara itu, untuk deteksi berbasis SYBR® Green, primer sebaiknya diposisikan pada ekson yang berbeda atau dirancang spesifik pada sambungan antar ekson. Penempatan kedua primer pada ekson yang sama berisiko memicu amplifikasi gDNA dan RNA secara simultan. Namun, dengan menempatkan primer pada ekson yang terpisah oleh intron, fragmen gDNA yang dihasilkan akan menjadi sangat panjang sehingga tidak teramplifikasi secara kompetitif di bawah kondisi termal real-time PCR.

Keberadaan pseudogen atau gen non-fungsional menjadi parameter krusial dalam perancangan primer. Secara biologis, pseudogen merupakan sekuens turunan dari gen fungsional yang tidak lagi aktif akibat akumulasi mutasi maupun alterasi pada struktur genetik serta wilayah promotornya. Guna mencegah aniling primer pada pseudogen maupun produk transkripsinya, penggunaan perangkat lunak dengan fitur BLAST® sangat direkomendasikan untuk menjamin spesifisitas amplifikasi.

Selain itu, variasi alel, yaitu dua atau lebih bentuk unik dari suatu gen yang menempati lokus kromosom yang sama, juga harus diperhitungkan. Transkrip dari variasi alel dapat berbeda satu sama lain akibat satu atau lebih mutasi. Perbedaan kandungan GC antar alel dapat mempengaruhi efisiensi amplifikasi dan menghasilkan puncak ganda pada melt curve, yang berpotensi disalahartikan sebagai amplifikasi non-spesifik. Varian hasil alternative splicing juga perlu dipertimbangkan pada tahap desain primer.

Primer & probe design merupakan salah satu tahap penting dalam membangun assay Real-Time PCR yang spesifik dan reliable. PT. Enigma Saintia Solusindo menyediakan jasa desain primer dan probe untuk membantu menyesuaikan assay dengan target dan kebutuhan penelitian Anda. Kami dapat membantu dalam proses pemilihan target, desain primer/probe, serta evaluasi karakteristik dan spesifisitas sekuens sebelum digunakan dalam eksperimen.

Punya target gen atau kebutuhan assay tertentu? Konsultasikan kebutuhan primer & probe design Anda bersama Enigma!

📩marketing@enigma-saintia.com
📞+62 21 30439742
📱+62 851-5779-2648